Uporabnik:Vitosmo/Histologija4

Namen priprave tkiva je iz tkiv odstraniti vodo in jo zamenjati z medijem, ki v strjenem stanju omogoča z vzorca odrezati tanke rezine. Biološko tkivo mora podpirati trda matrica, da omogočajo dovolj tanek oddelkov, zmanjšati, drugače tankih rezin (5 µm (μm; 1000 μm = 1 mm) za svetlobno mikroskopijo in 80-100 nm (nanometer; 1,000,000 nanometrov = 1 mm) za elektronsko mikroskopijo) ni mogoče ustvariti. Za svetlobno mikroskopijo se najpogosteje uporablja parafinski vosek. Ker se z vodo ne meša, je vodo kot glavno sestavino vsakega biološkega tkiva najprej iz vzorca odstraniti. Da se iz njih odstrani voda, se vzorci se prenašajo skozi kopeli vse bolj koncentriranega etanola. Temu sledi kopel v hidrofobnem čistilu (npr. ksilenu), ki odstrani alkohol, in končno v staljenem parafinskem vosku, to je sredstvu za prepajanje, ki nadomesti ksilen. Parafinski vosek  je za rezanje zelo tankih oddelkov za elektronsko mikroskopijo premehka matrica. Namesto njega se zato uporabljajo smole. Najpogosteje se uporabljajo epoksi smole, poleg njih tudi akrilne smole, še posebej v immunohistokemiji. Debelejše rezine  (od 0,35 µm do 5µm) v smolo vsajenih tkiv je mogoče tudi rezati za svetlobno mikroskopijo. Tudi epoksi in akrilne smole se z vodo ne mešajo, tako da je vzorec ravno tako treba dehidrirati, običajno z etanolom.

Ko so vzorci enkrat dehidrirani, očiščeni, in prepojeni s sredstvom za utrjevanje, kot je npr. parafin, se jih pusti, da se sredstvo strdi.  Če gre za parafinski vosek, se jih pusti, da se ohladijo, pri epoksi smolah pa se jih segreje, da se smola posuši oziroma strdi. Akrilne smole se polimerizirajo s segrevanjem, ultravijolično svetlobo, ali s pomočjo kemijskih katalizatorjev.  Otrdeli bloki z vzorci tkiva so tako pripravljeni za rezanje.

Ker se  tkiva, fiksirana s formalinom in vgrajena v  parafin (FFPE), lahko hranijo za nedoločen čas na sobni temperaturi, in ker je iz njih mogoče izločiti nukleinske kisline (tako DNK kot RNK) tudi desetletja po fiksaciji, so tkiva FFPE pomemben vir za zgodovinske raziskave v medicini.

Tkivo lahko vgrajujemo tudi z zamrznenjem ne-mastnega vzorca v medij na vodni osnovi. Predhodno zamrznjeno tkivo se vstavi v kalupe s tekočim sredstvom za utrjevanje, ki je običajno glikol na vodni osnovi, OCT, TBS, kriogel ali smola, ki se nato zamrzne v blok za nadaljnjo obdelavo.

Fiksiranje s formalinom vodi v tkivih do razkroja mRNK, miRNK in DNK. Vendar pa obstajajo metode, ki iz tkiv, fiksiranih s formalinom in vgrajenih v parafin, lahko izločijo, razmnožijo in analizirajo tudi te snovi.

Študenti medicine (letnik 2012)  na Instituto Nacional de Cardiologia v Mehikipripravljajo vzorce človeškega želodca za kasnejšo histološko analizo.

Tudi tkiva iz rastlin, gliv in mikroorganizmov je mogoče  histološko obravnavati. Njihova struktura se od strukture živalskega tkiva zelo razlikuje. Pri rastlinah se študij tkiv bolj pogosto imenuje rastlinska anatomija, gre za naslednje glavne tipe:

Obstajajo štiri osnovne vrste živalskih tkiv: mišično tkivo, živčno tkivo, vezivno tkivo in epitelno tkivo. Vse vrste tkiva so podtipi teh osnovnih štirih vrst - tako je na primer kri razvrščena med vezivna tkiva, saj so krvne celice suspendirane v zunajcelični plazmi).

V 19. stoletju je histologija postala samostojna akademska disciplina. Francoski anatom Bichat je leta 1801 v  anatomijo uvedel pojem tkiva,  ime  "histologija" pa se je prvič pojavilo v knjigi Karla Meyerja leta 1819.

Santiago Ramón y Cajal v svojem laboratoriju

Histologija je študij mikroskopske anatomije (mikroanatomije) celic in tkiv pri rastlinah in živalih. Običajno gre pri tem za opazovanje celic in tkiv pod svetlobnim mikroskopom ali elektronskim mikroskopom, v vzorcu, ki je bil seciran (narezan na tanke rezine z mikrotomom), obarvan in nato nameščen na mikroskopsko stekelce. Histološke študije se lahko tudi opravljajo na kulturi tkiva, v kateri se izolirane človeške ali živalske celice ohranjajo v umetnem okolju za različne raziskovalne projekte. Možnost vizualizirati mikroskopske strukture in med njimi razlikovati se pogosto krepi s pomočjo histološkega barvanja. Histologija je pomembno orodje za biologijo in medicino.

Tipičen histološki vzorec:

1. glass microscope slide
2. glass coverslip
3. stained tissue section, mounted between 1. and 2.

Artefakti lahko nastanejo med obdelavo tkiva. Obdelava pogosto povzroči spremembe, kot je krčenje, izpiranje posameznih celičnih komponent, spremembo barve v različnih vrstah tkiva in spremembe struktur v tkivu. Ker te so nastale v laboratoriju večina post histologija artefaktov mogoče izogniti ali jih odstraniti, potem ko je odkril. Običajen primer je merkur pigment zaostaja po uporabi Zenker je fiksativa , da se določi oddelek.

Tipičen histološki vzorec, nameščen med objektivno in krovno stekelce, na miizici svetlobnega mikroskopa.

OKT embedding (Optimalno Rezanje Temperatura spojina)

Postopek na osnovi zmrznjenih rezin, zmrznjenih v tako imenovanem kriostatu,  je hitra metoda za pripravo rezin za histološke namene. Pogosto se uporablja po kirurški odstranitvi tumorjev, ker omogoča hitro odgovoriti na vprašanje, ali je tumor bil v celoti odstranjen.

• Kožno tkivo
  
• Žilno tkivo
• Talno tkivo
  
• Merizmatično tkivo
  

Nobelovo Nagrado za fiziologijo ali medicino sta leta 1906 dobila histologa Camillo Golgi in Santiago Ramon y Cajal. Znani so njuni dvoboji glede tega, kaj slike vzorcev možganov kažejo in kako jih je razumeti. Cajal je bil nagrajen za svojo pravilno teorijo, Golgi pa za izum tehnike za barvanje vzorcev, ki je njuno debato konec koncev omogočila.

Histopatologija, raziskovanje obolelih tkiv pod mikroskopom, je pomembno orodje v anatomski patologiji , saj se za točno diagnozo raka in drugih bolezni običajno zahteva histopatološki pregled vzorcev. Usposobljeni zdravniki, pogosto z licenco patologa, so strokovnjaki, ki opravljajo histopatološki pregled in nudijo na podlagi svojih opazovanj za diagnozo pomembne ugotovitve. Histološke vzorce pripravljajo za pregled usposobljeni strokovnjaki, t.i. histološki tehniki (HT) ali medicinske znanstvenice in znanstveniki, medicinsko laboratorijsko tehnično osebje, ali znanstveniki s področja biomedicine in biomedicinske znanstvene podpore. Področje njihovih dejavnosti se imenuje histotehnologija.

Normalno patterning tkiv in artefakte, ki izhajajo iz tkiva postopek priprave zagotovitev, da vsak, histološki oddelek je edinstven. Kot kos bioloških umetnosti te slike zagotavlja globok vpogled v organizacijo in delovanje našega telesa. Histološki vzorci, ki izgledajo kot vsakdanje predmete ali funkcij, ki se pojavljajo na področju socialnih in znanstvenih skupnosti in celo v histopathology list izdelkih. Histologijo je področje znanosti, kjer se umetnost in znanost zadenejo. To dokazuje, da histologijo lahko cenijo ne samo podrobnosti usmerjena patolog, ampak tudi umetnost ljubeč laik in je kar histologijo in patologija bolj dostopni in manj zastrašujoče kot kompleksna znanost.

Artefakti

Rezanje

Kemično fiksiranje s formaldehidom in drugimi kemikalijami

Za svetlobno mikroskopijo se uporablja v mikrotomu jeklen nož, ki reže 4 mikrometre debele rezine tkiva in jih odlaga na stekla za mikroskopiranje. stran. Za presvetljevalno elektronsko mikroskopijo se uporablja diamantni nož v t.i. ultramikrotomu, reže 50 nanometrov debele rezine, ki se odlagajo na bakreno mrežo s premerom 3 milimetrov. Tako pripravljene vzorce se nato obarva.

• Epitel: obloge žlez, črevesja, kože in nekaterih organov, kot so jetra, pljuča in ledvica
• Endotel: obloge krvnih in limfnih žil
• Mezotel: obloge pljučnih in srčnih votlin
  
• Mezenhim: celice, ki polnijo prostor med organi, tako maščobne, mišične, kostne celice, celice hrustanca in kit
  
• Krvne celice: bele in rdeče krvne celice, vključno s celicami v bezgavkah in vranici
• Nevroni: vse prevajajoče celice živčnega sistema
• Klične celice:  reproduktivne celice (spermatozoidi pri moških, oociti pri ženskah)
• Posteljica: organ, značilen za prave sesalce med nosečnostjo; povezuje mater in potomce, zagotavlja izločke žlez z notranjim izločanjem in selektivno izmenjavo topne vsebine krvi, preprečuje pa prehod delcev
  
• Izvorne celice: celice s sposobnostjo, da se razvijejo v različne vrste celic

Zgodovina

Priprava - dehidracija, čiščenje in prepajanje

Rez skozi tkivo je mogoče narediti v več smereh. Za patološko vrednotenje tkiv je najobičajnejši navpični rez, pravokotno na površje tkiva.. Horizontalni rez, znan tudi kot prečni ali vzdolžni rez, reže vzdolž dolge osi tkiva, ki se pogosto uporablja pri raziskavah lasnih mešičkov in pilosebacealnih folikul. Tangencialni rez se uporablja v operaciji Mohs in v metodah CCPDMA.

V 17. stoletju je italijan Marcello Malpighi izumil eden prvih mikroskopov za proučevanje majhnih bioloških vzorcev. Malpighi je pod mikroskopom analiziral številne sestavne dele organov pri netopirjih, žabah in drugih živalih. Med preučevanjem strukture pljuč je razločil z membranami obdane alveole in lasem podobne povezave med venami in arterijami, ki jih je imenoval kapilare. Njegovo odkritje je pojasnilo, kako kisik, ki ga vdihavamo, pride v krvni obtok in s krvjo v telo.

Vzorec sapnika, obarvan s  hematoksilinom in eozinom

Primer barvanja za svetlobno mikroskopijo:s karminom obarvan monogenean (parazitski črv)

Biološka tkiva imajo, tako v svetlobni kot tudi v elektronski mikroskopiji, sama po sebi malo kontrasta.  Z barvanjem se  povečuje kontrast v tkivu, poleg tega pa se tako lahko poudarijo posebno zanimive podrobnosti. Kadar se govori o kemijskem ozadju podlaga postopka, se za barvanje uporablja  izraz histokemija. Hematoksilin in eozin (H&E barvili madeže) se najpogosteje uporabljata za barvanje vzorcev za svetlobno mikroskopijo v  histologiji in histopatologiji. Temeljno (bazično) barvilo hematoksilin, barva  zaradi afinitete do nukleinske kisline celična  jedra modra; ezin, kislo barvilo rožnate barve, pa po drugi strani barva citoplazmo. Uranil acetat in svinčev citrat se pogosto uporabljata za izboljšan kontrast tkiva pod elektronskim mikroskopom.

Obstaja še veliko drugih tehnik, ki selektivno barvajo različne vrste celic ali njih različne sestavne dele. Ena od teh tehnik na primer se uporablja za označevanje perifernih tumorjev ali kirurških robov: eno barvilo se uporablja za zadnji del vzorca, drugo za sprednji, itd, tako da je kirurgu mogoče ugotoviti, kje v tkivu se tumor v vzorcu nahaja. Druge spojine, ki se uporabljajo za barvanje rezov tkiva,. so med drugim zafranin, Oljno Rdeče O, Kongo rdeče, Hitra zelena FCF, srebrne soli, in številna naravna in umetna barvila, ki običajno izvirajo iz razvoja barvil za tekstilno industrijo.

Histokemija je veja znanosti, ki si pomaga s kemičnimi reakcijami med med laboratorijskimi kemikalijami in sestavinami v tkivu.  Pogostgo uporabljena histokemična metoda je Perlova reakcija s Prusko modro barvo, ki se uporablja za dokazovanje usedlin  železa pri boleznih kot je na primer hemokromatoza.

Histologija vzorci so pogosto bili pregledani z radioaktivnimi tehnike. V historadiography, diapozitiva (včasih obarvajo histochemically) je X-rayed. Bolj običajno, autoradiography se uporablja za predstavitev lokacije, ki radioaktivnih snovi je bilo odpeljano v telo, kot je celic v S fazi (v postopku replikacije DNK), ki vsebujejo tritiated thymidine, ali spletna mesta, ki radiolabeled nukleinske kisline sond, ki se vežejo na situ hybridization. Za autoradiography na mikroskopski ravni, stran je običajno, namočene v tekočino jedrske trakta emulzija, ki se suši v obliki izpostavljenosti film. Posamezna zrna srebra v filmu, so vidne tudi s temno polje mikroskopijo.

Protitelesa je mogoče uporabiti za prikaz in raziskavo beljakovin, ogljikovih hidratov in lipidov. Ta postopek se imenuje imunohistokemija, oziroma immunofluorescenca, kadar se za barvanje uporabi fluorescentna molekula. Ta tehnika je močno razširila našo zmožnost, pod mikroskopom prepoznati razne vrste celic. Druge napredne tehnike, kot  je ne-radioaktivna hibridizacija in situ, lahko v kombinaciji z imunokemijo razpozna posebne vrste molekul DNA ali RNA, in sicer s pomočjo fluorescentnih sond ali oznak, ki se lahko uporabljajo za imunofluorescenco in  z encimi povezano ojačano fluorescenco (še posebej ojačanje signala alkalne fosfataze in tiramida). Fluorescenčna mikroskopija in konfokalna mikroskopija se uporabljata za opazovanje fluorescentnih signalov z dobro ločljivostjo znotraj celic. Za zajem, za  histološko in histopatološko opazovanje se vse bolj uporabljajo digitalne kamere.

Skupni laboratorij madežev

Po histologiji

Artefakti so strukture ali funkcije v tkivu, ki ovirajo normalen histološki pregled. Ti  V normalnem tkivu niso vedno prisotni, lahko so posledice zunanjih virov. Artefakti motijo histološko analizo, ker spremenijo videz tkiva in skrivajo njegovo strukturo. Lahko jih razdelimo na dve kategoriji:

Tabela iz Michael H. Ross; Wojciech Pawlina (2006).

Nisslova in Golgijeva metoda sta koristni pri identifikacijo nevronov.

To so funkcije in strukture, ki so prišle v tkivo pred odvzemom vzorca.  Običajen primer sta na primer: črnilo iz tetoviranja in pege (melanin) v vzorcu kože.

Barvanje

Fiksirano ali nefiksirano tkivo se lahko zamrzne in reže v mikrotomu, ki je montiran v hladilno napravo, t.i. kriostat. Zamrznjeni rezine se nameščajo na steklo in se lahko obarvajo, kar povečuje kontrast med različnimi tkivi. Nefiksirane  zamrznjene rezine se lahko uporabljajo tudi za raziskave, ki zahtevajo lokaliziranje encimov v tkivu in celicah. Za nekatere postopke, kot je na protitelesa  vezano immunofluoreščenčno obarvanje, je treba vzorec fiksirati. Iz zamrznjenih rezin je tudi mogoče ugotoviti, ali gre pri novotvorbi, na katero je kirurg  slučajno naletel med operacijo, za zločesti tumor.

Vsajanje v plastiko se pogosto uporablja pri pripravi materiala za elektronsko mikroskopijo. Tkiva se vgradijo v epoksi smolo. Zelo tanke rezine (manj kot 0,1 mikrometra) se odrežejo z diamantnim ali steklenim nožem.Rezine se  obarvajo z barvili z visoko elektronsko gostoto  (uran in svinec), tako da jih je mogoče razločiti pod elektronskim mikroskopom.